单细胞测序揭示肝癌免疫微环境和中性粒细胞异质性

前言

原发性肝癌（PLC）有肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和肝细胞-肝内胆管癌（CHC）3种主要组织学亚型。世界上肝癌 50%的发病率和 55%的死亡率都在中国，因此肝癌被称为“癌中之王”。除了手术切除、放疗、化疗、靶向治疗等手段外，也可以介入癌细胞所赖以生存的“微环境”，即通过免疫调节激发免疫系统的潜力来对抗癌症。

中性粒细胞在肿瘤中的作用日益凸显，不过由于它的寿命短以及处理技术复杂，因此中性粒细胞在肿瘤中的功能异质性还不清楚。为了在免疫治疗方面取得更多的进展，作者对原发性肝癌的基础肿瘤免疫微环境(TIME) 进行了深入分析。

肝癌的单细胞图谱

作者对124 名初治患者（包括 79 名 HCC、25 名 ICC 和 7 名 CHC）的 160 个样本进行分析，得到1,092,172 个细胞，鉴定出 89 个 TIME cluster

5个肿瘤微环境亚型

作者基于细胞群、marker基因表达、TIME相关富集通路和预后的关系四个方面，将肿瘤微环境分成了5个亚型：CM1-CM5。

发现趋化因子和细胞因子及其受体的联系可能是形成不同亚型的潜在原因，比如CXCL9/10/11–CXCR3受配体在TIME-IA富集。

中性粒细胞的异质性

TIME-ISM中存在大量的中性粒细胞，因此将其中的中性粒细胞继续细分得到11个亚群，包括外周血来源（PBNs），癌旁的中性粒细胞(ALNs) 和肿瘤相关中性粒细胞(TANs)。

之后继续关注TANs，首先针对CCL4+ TANs (Neu_11_CCL4)：分别在单细胞、体外TANs、ATAC-seq、ELISA方法上验证了Neu_11_CCL4中CCL4的高表达，然后TANs共培养发现，相比于non-TAN，它可招募更多自体单核细胞，提示TANs可通过CCL4-CCR5受配体招募更多巨噬细胞。

然后针对CD274+ /PD-L1+ TANs (Neu_09_IFIT1 )，发现CD274（PD-L1）在Neu_11_CCL4中高表达。因为PD-L1的高表达经常与T细胞活性失调相关，所以进一步将TANs与T细胞共培养，之后发现T细胞毒性和活性相关标记（IFNγ；CD25和CD69）表达下调，而抗PD-L1抗体可以逆转这一过程，说明PD-L1介导了TANs的免疫抑制功能。

人和小鼠肝癌中存在保守的中性粒细胞亚群

为了进一步检查体内 TAN 的异质性功能，作者建立了两个新的自发性肝癌小鼠模型，其中 pTMC 小鼠主要发展为 HCC，而 pTMK 小鼠主要发展为 ICC。

作者对 21 个样本进行了 scRNA-seq 分析，包括从 6 只小鼠收集的外周血、肿瘤邻近肝脏和肿瘤组织，总共 17,780 个中性粒细胞被分成 12 个cluster。

发现人类和小鼠存在保守的中性粒细胞亚群。来自 TIME-ISM (Neu_09/10/11) 的三个 TAN 子集分别对应于 mNeu_10/11/12。值得注意的是，在小鼠 TAN 中观察到更高的Cd274表达，与人类 TAN 中的一致。

清除中心粒细胞可以减缓肿瘤进展

作者对小鼠进行anti-Ly6G 抗体处理清除中性粒细胞，发现肿瘤负荷和淋巴转移减少，巨噬细胞减少，CD8+T细胞耗竭相关免疫检查点（TIM，PD-1）的表达均减少。说明中性粒细胞的减少可减弱巨噬细胞招募和 T 细胞抑制，从而导致肿瘤抑制。

小结

作者构建了5种肝癌免疫微环境亚型，发现肿瘤相关中性粒细胞促进肝癌进展，清除中性粒细胞则可提升肿瘤免疫，抑制肿瘤进展。