单细胞DNA测序揭示肝细胞癌的克隆进化

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摘要

肝细胞癌 (HCC) 约占原发性肝癌的 80%，是全球癌症相关死亡率的第三大原因。目前的靶向疗法和免疫疗法在 HCC 中的疗效有限。目前对HCC的瘤内异质性 (ITH) 研究主要还存在于组织阶段，而由于基因组不稳定性引起的拷贝数改变 (CNA)是 ITH 的主要来源。

本文使用 11 个 HCC 病例的总共 1631 个细胞的 scDNA-seq 和来自另外 3 个 HCC 病例的 27,344 个细胞的 scRNA-seq。提出了 HCC 中双相拷贝数进化 (DPCNE) 的新模型，该模型也适用于其他癌症类型。基于该模型，发现了CAD是一种参与嘧啶合成的新型候选基因，与延长的渐进期、快速的肿瘤发生和降低的存活率相关。

单细胞 DNA 测序鉴定了肿瘤组织中的 3 个细胞亚群

作者分别对来自肿瘤组织的 1222 个细胞和来自相邻非肿瘤肝 (AL) 组织的 53 个细胞进行了 scDNA-seq。在肿瘤组织中鉴定出三个细胞亚群：

为了探索这些细胞之间的异质性，作者专注于非整倍体细胞。每个细胞基因组改变的百分比，包括扩增和缺失，在患者内部以及患者之间存在很大差异。tSNE发现，同一患者的非整倍体细胞落入同一个cluster，不同患者的细胞落入不同的cluster。

HCC 肿瘤高 ITH 的进化模型

作者首先选择 P9 作为示例。P9 得到了 123 个细胞，包括 7 个整倍体、27 个假整倍体和 89 个非整倍体细胞。在 P9 中整个基因组的 71 个区域中的识别出总共 66 个 CNA。假整倍体细胞含有 1 到 16 个 CNA；非整倍体细胞，鉴定了 33 至 58 个 CNA。非整倍体细胞与假整倍体细胞共享的 CNA 百分比要高得多。意味着克隆多样性在早期阶段很大，然后随着肿瘤进展而减少，表明具有潜在的克隆扩增。

为了定量评估 P9 中的进化模型，比较了以下 3 种数学拟合：GCNE 模型的线性拟合、PCNE 模型的一步拟合和新型 DPCNE 模型的组合拟合。使用了4种评价指标：调整后的R^2、预测的R^2 、贝叶斯准则和Akaike 准则。 DPCNE 模型（调整后的R^2 = 0.9988，预测的R^2 = 0.9987）优于两个 GCNE 模型（调整后的R^2 = 0.9417，预测的R^2 = 0.9414，P < 2.22E-16) 和 PCNE 模型（调整R^2 = 0.9848，预测R^2 = 0.9846，P < 2.22E-16）

为了探索 DPCNE 是否适合其他患者，作者为所有患者构建了系统发育树。大多数患者的发育树表现出短树干和长树枝，表明 CNA 逐渐积累是占据主导的。然后研究了这些患者的非整倍体细胞，CNA的差异范围为 8 到 25，远高于 PCNE 模型中提出的1- 3，表明肿瘤细胞在肿瘤进展的晚期不断获得 CNA。

在 P9、P6、P7 和 P8 中，作者观察到 DPCNE 拟合优于其他 2 个拟合的明显优势，这与这 4 名患者的长期进化阶段一致，这组被定义为G-group。在其余患者中，DPCNE 的拟合结果相对于 PCNE 模型显示出相对较小但显着的优势，与相对较短的渐进进化阶段一致，这组被定义为P-group。

然后定量比较了每个肿瘤与其他肿瘤的 PWD-CNA，在 G 组和 P 组肿瘤之间观察到最显著的差异；然后将每组的 PWD-CNA 值汇集在一起，发现 G 组的 PWD-CNA 明显高于 P 组。因此基于模型拟合对 P 组和 G 组肿瘤的分类是稳健的，并且具有渐进期的 G 组肿瘤表现出更高程度的 ITH。

CAD鉴定为 G 组的潜在驱动基因

为了探索 G 组中延长渐进阶段的潜在驱动基因，作者对 P 组和 G 组肿瘤之间的 CNA 进行了全基因组比较。两个组共有的CNA中有许多著名的驱动基因，例如TP53和AXIN1。有几个CNA在在 G 组中比较多，例如ARID2中出现的扩增以及TSC1和WNK2 的缺失。

作者根据 G 组肿瘤的 2 个特征（较短的 DFS 和较高的 ITH）设计了一种综合策略，以筛选 G 组富集的 CNA 中的基因。首先使用了 17 名具有不同 DFS 的 HCC 患者的大量 RNA-seq 数据，然后分为早期复发组（7 例，DFS < 6 个月）和晚期复发组（10 例，DFS > 24 个月），共鉴定出1146个差异表达基因，其中早期复发组613个基因上调，533个基因下调。之后作者在 G 组中鉴定了 19 个扩增基因和 28 个缺失基因，这些基因表现出与大量 RNA-seq 数据一致的表达模式。

接下来，作者在已发表的最大 HCC 数据集（TCGA-LIHC）中评估了 47 个候选基因与 ITH 之间的关联。发现一种新的候选基因CAD与 ITH 的程度呈最高正相关，CAD的表达在“ITH-高”组中更高。CAD编码氨甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酶(CAD)。最后确定CAD与较高的 ITH 和早期肿瘤复发相关。

先前的研究发现，CAD会参与嘧啶合成，它的上调可以加速癌症中的尿素循环代谢，通过支持合成代谢来增加肿瘤增殖。因此，血浆和尿液中与尿素循环相关的代谢物可作为 G 组患者、较高细胞 ITH 和早期肿瘤复发的生物标志物。