斯坦福团队绘制首张心脏细胞表观遗传组学蓝图，有望解码先天性心肌病发病机制，推动心血管疾病精准医学发展

“我们从 763 个先天性心肌患者的 54126 个原发性非蛋白编码区的单碱基突变点中，预测了最有可能导致该疾病的突变类型，确定了转录水平受影响的目的基因，借此绘制出动态心脏单细胞表观遗传组学图谱。”斯坦福大学心血管中心沈梦城博士表示。

研究中，他和所在团队还开发了神经网络深度学习模型，对于深入研究心脏发育和相关疾病的机制具有重要指导意义，相关论文发在 Cell 上。

（来源：Cell）

沈梦城说：“这项工作还能进一步推动人诱导干细胞分化技术的完善。理论上讲，如果诱导干细胞分化出的细胞与成体细胞在表观遗传组图谱、转录组图谱以及生理生化反应等层面无限接近，这款生物模型将更好地服务于新药研发并促进精准医学的发展。”

就研究意义来说，本次成果让我们得以进一步了解处于上游的表观遗传组，到底是如何通过在时间维度上精细地调控细胞类型特异性转录组的动态变化，从而促进心脏正常发育的。

更重要的是，该团队不仅绘制了一个标准的心脏细胞表观遗传组的蓝图，还发开了一套基于神经网络深度学习模型以用于精准预测致病的碱基突变类型。对于精准解析导致先天性心肌病的非蛋白编码区单碱基突变类型，这一研究有着至关重要的指导意义。

基于研究中获得的细胞类型特异性转录因子的动态表达信息，课题组进一步优化了利用人诱导干细胞（human induced pluripotent stem cell，iPSC）获得特定心脏细胞的分化方法，让在体外条件下分化得到的细胞，与心脏内对应的细胞类型，在表观遗传标记、基因表达图谱以及生理学功能上更加趋于一致，从而能为实现精准医学比如细胞治疗和药物安全性与有效性筛选奠定基础。

（来源：Cell）

在应用前景上：

首先，本次成果可以促进与先天性心肌病相关的基因突变类型的精准判断，结合日渐成熟的基因编辑技术或其它基因调控手段，有望在宫内即可修复发育异常的心脏，从而从根本上消除先天性心肌病；

其次，可以促进人诱导干细胞分化心脏细胞的方法迭代，从而更好地实现精准医学、药物安全性评估以及药物开发；

最后，该研究也为成人心脏的伤后修复和再生提供了新思路和可行性材料。原因在于，受特定表观遗传组学和转录组精准调控的胚胎心脏细胞，普遍被认为具有更强的增殖能力。

因此，在成人受损心脏中，精准地重置由病人自身诱导干细胞分化所得的特定细胞类型，不仅可以支持组织的原位修复，还可以有效解决免疫排异的问题。

（来源：Cell）

如何探究先天性心肌病的诱因？先要找到一本“辞典”

据了解，本次成果主要面向探索先天性心肌病的致病机理。先天性心肌病，是新生儿群体中最为高发的一种心脏疾病，由于心脏在胚胎时期发育异常所致。

最新流行病学调查显示，在全世界范围内约有 0.8%-1.2% 的新生儿被诊断为先天性心肌病。

只有极少数的发育异常型心脏，可以通过心导管手术或心脏外科手术进行矫正，而大部分先天性心肌病的婴幼儿很难存活到成年。

另外，大约有 85% 的先天性心肌病患者的病因，仍然处于完全未知的状态，这给临床早期诊断和干预带来了很大的挑战。

因此，探究导致先天性心肌病的诱因，成为心血管疾病学的重要研究方向之一。其中，基因随机突变或者遗传性突变，被认为是导致先天性心肌病的重要诱因之一（约占 1/3）。

随着体内精准基因编辑技术的发展，假如能在胚胎发育早期检测出致病的碱基突变位点，理论上能在不久的将来通过精准的基因编辑技术修复突变，从而保证心脏在胚胎内的正常发育。

遗憾的是，在对较大样本量的先天性心肌病心脏样本进行全基因组测序之后，只有非常小比例的突变位点，被证实可以导致该疾病的发生。

究其原因，主要是因为 92% 以上的单碱基突变位点，位于非蛋白编码区。然而，到底哪些突变是致病突变？哪些突变可以调控与心脏发育相关的基因、尤其是关键的转录因子？关于这些问题目前依旧没有答案。

要想探知这一问题，就需要一个心脏特异性的表观遗传组学图谱来作为“辞典”，借此解码位于非蛋白编码区的、会导致先天性心肌病的单碱基突变位点，进一步通过生化实验来确立单碱基突变和受影响的基因，与先天性心肌病表型的因果关系。

因此，只有锁定了致病的突变位点，才能更好地利用基因治疗手段，在胚胎发育期间有效地纠正心脏细胞的异常发育，从而在源头上预防先天性心肌病的发生。

另外，人们逐渐发现：在研究致病机理、以及测试药物的潜在脱靶毒性效应和有效性上，人诱导干细胞具备无限的潜能。

因此，在体外分化出与组织内对应的细胞基因表达和生理学反应一致的细胞，就显得尤为关键。

然而，依旧存在一些技术瓶颈。究其原因在于，大家对于促进细胞发育和成熟的一系列动态、且复杂的基因表达调控网络，仍然知之甚少。

为实现这一目标，沈梦城所在的合作团队获取了第 6、8 和 19 周的健康人类胚胎心脏，利用单细胞染色质易开放区域测序技术，结合课题组的单细胞转录组测序数据库，绘制了 20 个主要心脏细胞类型在不同胚胎发育阶段动态的表观遗传组学图谱。

此外，他们还关联了细胞类型特异性的染色质易开放区域顺式转录元件、以及它可能调控的基因。

利用神经网络模型和深度学习技术，在上述各细胞类型中，他们获得了单碱基清晰度的各种转录因子的图谱，借此首次解析出 8 个调控胚胎心脏中不同细胞类型发育的表观遗传组学水平的动态变化路径。

特别需要指出的是，该研究首次发现：这些突变往往通过影响特定的细胞类型来导致先天性心肌病。

例如，在该团队确定的与先天性心肌病有关的单碱基突变类型中，大约有 2/3 主要富集在动脉内皮细胞中，这一发现颠覆了心肌细胞中的基因突变是导致先天性心肌病的主要诱因的传统理论。

近日，相关论文以《心脏发生的综合单细胞分析确定了先天性心脏病的发育轨迹和非编码突变》（）为题发表在 Cell 上 [1]。

图 | 相关论文（来源：Cell）

斯坦福大学癌症生物学系穆罕默德·阿明（Mohamed Ameen）博士和遗传学系的拉士曼·桑达拉（Laksshman Sundaram）是并列第一作者，该校心血管研究中心的沈梦城博士是第二作者。

几位通讯作者均来自斯坦福大学：他们分别是心血管研究所的扬尼斯·卡拉基克斯（Ioannis Karakikes）教授、癌症生物学系的凯文·王（Kevin C.Wang）教授、心血管医学系的托马斯·克特莫斯（）教授、遗传学系的威廉·格林利夫（）教授、以及遗传学系和计算机科学系的安舒尔·昆达耶（）教授。

基于该论文的前瞻性和医学转化的巨大潜能，Cell 主编将其列为了重点关注文章。

（来源：Cell）

论文图片和内文前后修改 50 余版

据介绍，随着单细胞测序技术的不断发展，越来越多的学者开始针对人和鼠的心脏，进行基因表达水平的测序研究，这为人们进一步了解心脏中细胞类型的种类、以及正常和病理状态下各细胞类型的表达图谱，提供了很好的公共资源。

但是，随着致病基因调控机制的深入研究，人们逐渐意识到：表观遗传组学层面的调控，对于组织器官的发展以及致病过程有着关键作用。

（来源：Cell）

鉴于担任本文共同通讯作者的 是研究单细胞染色质易开放区域测序技术的鼻祖，因此他首先提出：是否可以通过这项技术，来探索不同心脏细胞在发育过程中，染色质动态开放状态的变化？

于是， 课题组从斯坦福医院妇产科获取了不同时间段的胚胎样本，在提取心脏细胞的细胞核之后，进行了单细胞染色质易开放区域的测序。

在获得该数据之后， 团队向另一位通讯作者 的团队寻求帮助，以对数据进行深层次的分析。

Anshul 是业内著名的机器学习专家，近年来他和课题组优化以及开发了一系列深度学习模型，这些模型主要用于预测和分析基因调控的机制。

随着数据分析的不断深入， 逐渐吸引到其他领域的专家加入研究，比如心血管遗传学专家 、人诱导干细胞生物学专家 Joseph C. Wu、以及基因编辑专家 Ioannis Karakikes。

期间，他们开发了相关的神经网络深度学习模型并不断优化人诱导干细胞的分化方法，以便更精准地预测和验证导致先天性心肌病的单碱基突变位点。

在论文投稿前的 8 个月内，所有课题参与者们都废寝忘食地工作，论文图片和内容前后修改了不下 50 个版本。

2022 年初，由 教授向 Cell 杂志主编作了投稿意向的初步交流。“随后，Cell 杂志主编盛情邀请我们进行投稿。”论文第二作者沈梦城表示。

在论文评审期间，专家们认为在表观遗传组学层面，该研究填补了深入理解心脏发育和疾病在分子水平上调控机制的空白。

有趣的是，在论文上线之后，通讯作者们从 50 个论文初稿版本中精选出 10 个修改版本，作为科学写作的学习教材，并在斯坦福心血管中心和遗传医学中心开展了多次培训课程。

另外，多数参与到这一课题的成员都开始学习 Python 编程和深度学习技术。

而后，论文共同一作入职全球最大的测序公司之一 。如今，该公司已和课题组签订了长期的深度合作协议，旨在更多广度和维度上探索基因调控和疾病之间的关系。

通过这种多团队、多学科的深入交叉合作，以前只专注生物学技术和机器学习的教授们，也开始对心血管医学和生理学产生了浓厚兴趣，并利用研究期间积累的创新性数据申请了各类经费支持。这样的跨学科合作，无疑能对心血管医学的深入研究起到很好的推进作用。

另据悉，担任论文第二作者的沈梦城，在课题开展期间首创了一个由人诱导干细胞向动脉血管内皮细胞分化的方法。

图 | 沈梦城（来源：沈梦城）

目前，使用该方法分化出来的内皮细胞和原代细胞，在各个方面都是无限接近的。

如前所述，此次论文发现大量导致先天性心肌病的单碱基突变，富集在动脉内皮细胞中。

因此，他们打算利用这一全新的内皮细胞模型，以高通量的方式，验证所预测出的致病突变在先天性心肌病的决定性作用。

同时，沈梦城还独立开发出一套全新的心脏类器官分化方法，旨在将研究将从二维向三维进行过渡，这无疑将使后续研究结果更具有生理学意义。

他说：“我开发的内皮细胞分化方法具有成本低、效率高、重复性强的特性。由于人诱导干细胞的分化过程是严格按照《药品生产质量管理规范》的规格进行的，因此分化所得的内皮细胞还具有直接应用于细胞治疗的医学价值。”

目前，他和所在团队也在将人诱导干细胞分化的内皮细胞，用于治疗心肌缺血再灌注损伤后的心脏修复实验，基于这种内皮细胞分化方法和应用的论文，预计将在 2023 年底发表。

参考资料：

1.Ameen M, Sundaram L, Shen M, et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease[J]. Cell, 2022, 185(26): 4937-4953. e23.

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