转运相关

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纤毛是基于微管和膜包裹的真核细胞突起，在细胞运动、流体流动生成、感官知觉和细胞间信号传导中发挥重要作用。纤毛的生长是一个快速的过程：单细胞藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii） 可以在 90 分钟内长出 12μm 长的纤毛。在此期间，构建轴丝的数百种不同蛋白质，需要通过称为鞭毛内转运（IFT，intraflagellar transport） 的主动转运机制穿梭到纤毛中。在纤毛稳态中，鞭毛内转运从纤毛中去除不需要的蛋白质并通过在纤毛内外运输膜蛋白（ 包括 G 蛋白偶联受体和离子 通道）来调节依赖于纤毛的信号转导通路。因此，鞭毛内转运对于纤毛正常发挥功能至关重要。鞭毛内转运中的缺陷会损害纤毛组装和纤毛信号传导，导致一系列称为纤毛病的疾病，包括骨骼纤毛病、多囊肾病、视网膜退行性疾病和巴德-比德尔综合征等。尽管人们在 30 年前就发现了鞭毛内转运，但学界仍然不完全了解这种单一机制如何在两个不同的方向上，选择性地运输如此多的不同货物。鞭毛内转运依赖于称为 IFT train 的马达蛋白驱动的大蛋白质复合物（多兆道尔顿）穿梭机。IFT train 由高度保守的鞭毛内转运-A 和鞭毛内转运-B 复合体的重复单元组装而成，并装饰有适配器蛋白，可以扩展鞭毛内转运列车可以运输的货物数量和类型。顺行 IFT train 由马达蛋白 kinisen-2 提供动力，但也装载动力蛋白 dynein-2，后者为逆行运输提供动力。除了它们的不同组成外，顺行和逆行列车还沿着构成轴丝的双微管内的不同小管行进，这可以防止沿相反方向移动的列车之间发生碰撞。此前，学界在单个鞭毛内转运蛋白的结构和相互作用上取得了一定的进展。16 个鞭毛内转运-B 亚基中的 11 个的晶体结构已被解析或部分解析，而电子显微镜已用于最大的鞭毛内转运-B 亚基鞭毛内转运 172 成像。晶体学也被用于可视化鞭毛内转运-B 中发生的一些蛋白质-蛋白质相互作用，包括鞭毛内转运 25 和鞭毛内转运 27 之间的相互作用、鞭毛内转运 52 与鞭毛内转运 46 和鞭毛内转运 70 的关联，以及三聚体鞭毛内转运 22/74/81 复合物。然而，鞭毛内转运-A 的 6 个亚基的结构信息完全缺失。酵母双杂交分析、免疫共沉淀、可见免疫沉淀以及遗传相互作用分析等方法，已被用于生成鞭毛内转运亚基之间的相互作用网络。但是，这些方法无法提供鞭毛内转运外观和功能的全貌。除了这些方法之外，低温电子断层扫描（cryo-ET） 已经在原位揭示了 IFT train 的结构，但由于这种方法缺乏分辨率，因此无法确定鞭毛内转运蛋白各个亚基在复合物中的位置，并且越来越多的证据支持鞭毛内转运蛋白在囊泡运输中的额外作用。同时，鞭毛内转运-A 复合物亚基的组成形式，鞭毛内转运-A 如何结合囊泡、聚合成 IFT train 以及在这些状态之间的转换，都是对鞭毛内转运转运机制的理解具有重要意义，有待解决的根本性问题。为此，哈佛医学院阿兰·布朗（）实验室利用冷冻电镜单颗粒技术，首次解析了在利什曼原虫（L. tarentolae）中纯化的 native 状态的鞭毛内转运-A 复合物的近原子分辨率结构。结构揭示了鞭毛内转运-A 由两个子复合体鞭毛内转运-A1 和鞭毛内转运-A2 组成，它们由位于躯干中间的旋转接头连接在一起。在 native 利什曼原虫中，鞭毛内转运-A 复合体采取相对“close”的构象。（来源：Cell）他们发现鞭毛内转运-A1 和鞭毛内转运-A2 之间的相对旋转以及鞭毛内转运-A1 的灵活性，是成功聚合顺行 IFT train 的关键特征。另外，该团队还发现鞭毛内转运-A 可以通过它的 TPR 结构域结合体外重组的脂质体膜，并且对磷脂酸和神经酰胺具有特异性。令人惊讶的是，在顺行 IFT train 中，鞭毛内转运-A 的 TPR 结构域界面也与鞭毛内转运-B 相互作用。这一结果表明鞭毛内转运-A 结合膜，与在纤毛基部组装在顺行鞭毛内转运-B 上可能存在竞争关系。该团队还利用 AlphFold2 预测了人源鞭毛内转运-A 单个亚基的结构。根据这一鞭毛内转运-A 复合体结构，课题组构建了人源鞭毛内转运-A 的原子模型，分析了具有致病性的鞭毛内转运-A 突变在复合物上的位置、以及可能与识别运输蛋白相关的关键性位点，为以后鞭毛内转运-A 的功能性验证、以及鞭毛内转运-A 运输的货物蛋白的发现提供了新思路。评审专家分别表示：“这项研究将构成未来所有研究纤毛的生物学家的参考。在方法、实验质量或手稿准备方面几乎没有错。随着目前正在审查或预印本中的大量论文，我们将很快对顺行 IFT train 中的鞭毛内转运-A、鞭毛内转运-B 和马达蛋白有近乎原子的理解。 这种令人兴奋的进步在几年前是不可想象的，而目前的手稿提供

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